Utilizzo di Nile Blue e Nile Red per visualizzare la presenza di lipidi nei tessuti criosezionati (2023)

I lipidi sono elementi cruciali della biologia cellulare dei mammiferi (e non dei mammiferi), eppure i lipidi sono difficili da visualizzare in situ. Rispetto alle proteine, per le quali possiamo generare anticorpi, o ai carboidrati, alcuni dei quali possiamo rilevare utilizzando lectine fluorescenti, ci sono relativamente poche sonde fluorescenti specifiche per i lipidi. Molti lipidi sono altamente conservati tra le specie, rendendo molto impegnativa la produzione di anticorpi contro lipidi specifici.

Abbiamo recentemente pubblicato l'uso di Nile Blue, un colorante lipofilo, in combinazione con il suo derivato Nile Red, per il rilevamento di acidi grassi liberi e trigliceridi nelle cellule per l'imaging e la citometria a flusso (Boumelhem et al.,J Cell Sci(2022) 135 (5): jcs258322.https://doi.org/10.1242/jcs.258322). Questo documento vuole essere una "guida per l'utente" per l'utilizzo di Nile Blue e Nile Red per l'imaging di cellule fluorescenti. Sia Nile Blue che Nile Red emettono fluorescenza in presenza di lipidi in più specie. Abbiamo utilizzato entrambe le sonde per colorare cellule di roditori, linee cellulari tumorali umane, cellule marsupiali e persino planaria (dati non mostrati).

Cosa sono questi coloranti del Nilo?

Nile Blue è stato segnalato per la prima volta nel 1896 anche se potrebbe essere stato inventato già nel 1888. Nile Blue è una colorazione istologica fluorescente di ossazina, di colore blu. Le sue proprietà lipofile sono note fin dal 1908 (Lorraine, J., 1908. J Path. Bact. Vol 12, (1), 1-4https://doi.org/10.1002/path.1700120103). L'ebollizione del blu del Nilo con acido solforico produce il rosso del Nilo, una macchia lipofila distinta dal blu del Nilo sia in termini di lipidi rilevati che di proprietà fluorescenti. Entrambi i coloranti cambiano nelle proprietà fluorescenti in base alla presenza di lipidi nel loro microambiente locale piuttosto che legarsi direttamente ai lipidi. Nile Red è altamente solvatocromico, il che significa che la lunghezza d'onda della luce fluorescente emessa dipende dal solvente, e in particolare dalla polarità del solvente, in cui si dissolve Nile Red. Ciò significa che Nile Red può essere utilizzato come indicatore di polarità locale come la polarità sulla superficie delle nanoparticelle per esempio. Sia Nile Blue che Nile Red sono relativamente economici rispetto ad altre sonde lipofile fluorescenti. Entrambi sono relativamente semplici in termini di conservazione e scelta del solvente sebbene, come accennato, possano variare nelle proprietà fluorescenti a seconda dei solventi utilizzati per la ricostituzione. Solitamente produciamo una soluzione madre di Nile Blue in acqua distillata e una soluzione madre di Nile Red in DMSO. Entrambi possono quindi essere diluiti in PBS per l'uso con le cellule.

Nile Red ha un'ampia gamma di emissioni e può essere eccitato utilizzando i laser a 488 nm o 565 nm. Nile Blue è un colorante rosso lontano ed è eccitato a 625 nm. Tipicamente, il segnale fluorescente del rosso Nilo nelle goccioline lipidiche viene osservato nei canali rosso-arancio, mentre la fluorescenza del blu Nilo viene rilevata nei canali del rosso lontano. Ciò significa che i coloranti possono essere utilizzati in combinazione senza sovrapposizioni significative, anche se va notato che in alcune circostanze, Nile Red può spostarsi verso il rosso e fluorescenza nello stesso canale di Nile Blue. Sia Nile Blue che Nile Red sono permeabili alle cellule, a differenza di altre sonde lipofile come Oil Red O che richiede che le cellule debbano essere fissate prima dell'uso. Ciò fornisce un vantaggio in quanto i coloranti del Nilo possono essere utilizzati per l'imaging di cellule vive e la citometria a flusso rispetto alle classiche macchie lipofile. Per quanto ne sappiamo, nessuno dei due è altamente citotossico e gli studi pilota che coltivano cellule con entrambi i coloranti per diversi giorni non hanno provocato una morte cellulare significativa come osservato con l'imaging fluorescente di cellule vive.

Di quali lipidi questi coloranti emettono fluorescenza in presenza?

Abbiamo testato oltre 75 diversi lipidi con Nile Blue o Nile Red per valutare mediante spettrofluorimetria che inducono la fluorescenza di queste sonde. I seguenti elenchi si basano sui lipidi che abbiamo testato. Altri possono essere riportati in letteratura.

Blu Nilo:Nile Blue emette fluorescenza in presenza diacidi grassi liberi insaturi che sono almeno 16 atomi di carbonioin lunghezza.

I lipidi che inducono la fluorescenza del Nilo Blue includono;

-Oleato.

-Acido nervoso (presente nel cervello e precursore dei cerebrosidi)

-Acido erucico (presente nell'olio di senape e nell'olio di colza ma povero di colza)

-Acido elaidico (trovato in piccole quantità nel latte vaccino)

-Acido linoelaidico (un olio presente nei semi di durian)

-Acido palmitoleico (un lipide omega-7)

-Acido arachidonico (un notopolinsaturo acido grasso omega-6importante nella segnalazione cellulare e nella biosintesi degli eicanosoidi).

Tipicamente, ilcis-versioni di questi lipidi hanno indotto una maggiore fluorescenza rispetto alla lorotrans-controparti. Nile Blue mostra una specificità notevolmente stretta per questi lipidi (cis, >16-carboni, acidi grassi liberi insaturi).

Rosso Nilo:Nile Red emette fluorescenza in presenza di un ampio spettro di lipidi che tipicamente includono;

-Trigliceridi

- Colesterolo ed esteri del colesterolo

-alcuni fosfolipidi

-alcuni lipidi cerebrali.

Solo uno dei lipidi che inducono la fluorescenza del Nilo Blu induce anche la fluorescenza del Nilo Rosso, l'oleato.

Come usare questi coloranti per la microscopia

Poiché miravamo a utilizzare questi coloranti su sezioni, abbiamo valutato le tecniche per la colorazione di criosezioni di tessuti non fissati.

Protocollo per la colorazione della sezione:

1. Tessuti non fissati per criosezione: le temperature per il sezionamento sono state regolate in base al tipo di tessuto. Ad esempio, il tessuto adiposo ha richiesto la regolazione del criostato a -30°C (la temperatura più bassa disponibile su questo strumento) mentre tessuti come il cuore sono stati sezionati a -15°C.
2. Asciugare all'aria per un massimo di 15 minuti: in genere, le sezioni vengono lasciate asciugare all'aria a temperatura ambiente prima di essere conservate a temperature più basse. Tuttavia, ciò che abbiamo scoperto è che i lipidi iniziano a deformarsi dopo lunghi periodi di essiccazione, causando una distruzione dell'integrità e della morfologia cellulare.
3. Fissare i tessuti con paraformaldeide al 4% (in PBS) per 10-15 minuti. Evitare fissativi che rimuovono i lipidi come etanolo, metanolo e acetone.
4. Lavare con PBS e macchiare con Nile Red (300 nM) e Nile Blue (5 µM) per 10 minuti, lavare e montare con VectaShield contenente DAPI.
5. L'imaging è stato generalmente eseguito lo stesso giorno, tuttavia, l'integrità cellulare è rimasta intatta per giorni dopo la colorazione, purché le sezioni colorate fossero conservate in frigorifero a 4°C.

Cosa aspettarsi dall'immagine con questi coloranti

Il tipico schema di colorazione blu del Nilo per l'acido grasso libero insaturo nelle cellule di mammifero è una macchia citoplasmatica diffusa (vedere la Figura 1, pannello in alto a sinistra). Tuttavia, nel caso delle cellule adipose brune, la colorazione Nile Blue è stata osservata in intense strutture punteggiate, che potrebbero essere perossisomi. Queste strutture avevano un punto centrale di colorazione blu del Nilo circondato da un segnale rosso del Nilo. Nilo rosso goccioline tipicamente colorate all'interno delle cellule (vedi Figura 2, pannello in alto a destra). Mentre alcuni fosfolipidi hanno indotto la fluorescenza negli studi di spettrofluorimetria, non è stata osservata la colorazione della membrana cellulare. Il Nile Red è visto nella gamma rosso-arancione sui microscopi confocali e il segnale Nile Blue può essere visto nella gamma del rosso lontano. Nei tessuti con cellule contenenti goccioline di retinolo/vitamina A, come le cellule stellate epatiche, note anche come cellule di Ito, è possibile rilevare un segnale autofluorescente nel canale del violetto. Non utilizzare DAPI se si desidera rilevare anche retinolo/vitamina A nelle goccioline nelle cellule stellate epatiche poiché l'emissione fluorescente di DAPI e vitamina A si sovrappone. Si consiglia una controcolorazione che emette nella gamma verde dello spettro come YOYO-1 per i nuclei o Phalloidin-Atto488 per il citoscheletro per identificare le singole cellule. Nile Blue e Nile Red sono indicatori fluorescenti economici ed efficaci di diversi lipidi nelle cellule di mammifero che possono essere utilizzati contemporaneamente (vedi Figura 1, pannello inferiore). Possono essere combinati con altri segnali autofluorescenti come la vitamina A o anticorpi marcati con fluorescenza. A causa della loro permeabilità cellulare, Nile Blue, Nile Red e altri composti autofluorescenti possono essere utilizzati per la citometria a flusso.

Gli autori

Gli autori sono più che felici di aiutare a consigliare i ricercatori con l'uso di questi coloranti per valutare il contenuto lipidico all'interno delle cellule.

Badwi Bob Boumelhem: badwi.boumelhem@sydney.edu.au

Stuart Fraser*:stuart.fraser@sydney.edu.au

Scuola di Ingegneria Biomedica, Facoltà di Ingegneria,

Università di Sydney Camperdown, NSW, 2050, Australia

* Indirizzo corrente:

Cardiologia Molecolare, Istituto del Centenario,

Royal Prince Alfred Hospital, NSW, 2050, Australia

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